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dsRNA克隆方法综述

发布者:鑫达医学翻译 发布时间:2012-09-26阅读:

自然界的dsRNA基本上是以病毒的基因组形式存在的。相对于ssRNA,dsRNA非常稳定,其稳定性与dsDNA相当。此外,ssRNA植物病毒在寄主体内复制时,会产生高拷贝量且稳定的dsRNA复制中间体形式。目前已确定的植物病毒中,84.5%为RNA病毒(ssRNA病毒占79.22%,dsRNA病毒占5.28%),因此研究如何以dsRNA为模板获得未知RNA病毒的基因组全序列,对于认识新病毒来说具有更普遍的意义和更多的优点[1]。
经过几十年的研究,dsRNA克隆方法由繁琐、复杂到简单、快捷,取得了一定的进步,目前为止,已有以下几种方法用于以dsRNA为模板获得序列克隆:(一)随机引物法建立cDNA文库路线;(二)dsRNA加poly(A)尾法;(三)同源序列设计引物法;(四)单引物扩增法;(五)序列片段扣除法。

一、dsRNA加poly(A)尾法
该方法利用寡核苷酸多聚酶在dsRNA模板的3`末端形成一个Poly(A)尾,再用oligo(dT)作为5`端引物,反转录形成cDNA第一条链,之后用RNase H消化DNA/RNA杂合链中的RNA,再经DNA聚合酶l和连接酶的作用,得到双链cDNA。末端转移酶给cDNA的另一侧加上oligo(dC),以oligo(dT)和oligo(dG)为引物进行PCR扩增,将扩增片断连接到载体上,转化大肠杆菌,经扩增后进行测序分析[1]。Yun-ping Zhang, Adib Rowhani利用这种方法成功克隆了植物RNA病毒[6]。Cloete用这种方法克隆了3-4kb的非洲马病病毒AHSV基因组片段1和2的全长序列[10]。
此法中poly(A) 尾的cDNA 合成方法反应条件难以控制,加尾效率低,加尾数难以掌握,常常造成整个实验失败[2]。
二、cDNA文库克隆法
采用病毒基因组片段的随机克隆进行DNA 快速测序及进行相应的核苷酸片段编码氨基酸分析的方法,已应用于对未知的原核及真核生物的研究中[2]。该方法利用随机六聚体引物,进行反转录,获得片断大小不同的cDNA第一条链,碱法降解与新合成的cDNA 第一链互补的RNA 模板后,以退火的方式形成ds – cDNA,利用polymeraseⅠ将末端补平。cDNA产物在T4连接酶作用下与载体连接,进而进行测序分析。序列测定后,利用序列重叠法得出整个基因组dsRNA的全序列。中科院武汉病毒研究所的田静、方勤用这种方法,以鱼呼肠孤病毒双链RNA 为模板,建立了一种cDNA 合成及克隆策略[2],他们 应用了大量的dsRNA,从而可以直接通过琼脂糖凝胶电泳检测其cDNA 合成产量。运用同样的方法,田静等人首先完成的是草鱼出血病病毒基因组的cDNA合成及克隆[13]。这种方法对于克隆长片段是非常有用的[4],但此法类似于DNA测序中的“鸟枪法”策略,整个过程步骤繁琐,工作量大。
 三、同源克隆法
对于与已知病毒属于同一属种的未知RNA病毒基因组序列的克隆,可以采用此法进行。同一种属的病毒中,其基因组序列往往存在一定的同源保守区,不同种属或同种不同株系间变化不大甚至无变化,因此,可以根据已知病毒基因组序列保守区设计引物,对未知病毒序列进行RT-PCR,产物连接于载体上进行序列测定分析。刘小军等用这种方法克隆了我国不同地区的IBDV VP2基因,并对其核苷酸序列进行比较分析,探讨不同毒株间变异的分子机制,并为基因工程疫苗的产生奠定了基础[8]。张玉满等用此法进行了葡萄卷叶病毒外壳蛋白基因的克隆[9]。邓文生等根据已知玉米粗缩病毒 (MRDV)的部分序列设计引物、反转录、PCR扩增,克隆并测序分析了MRDV的第七片段 (S7)cDNA序列[18]。
同源序列设计引物法简单快捷,耗时短,几个小时即可完成。但是,这种方法不能解决新发现种属病毒的基因组序列的克隆,应用范围窄。
四、单引物扩增法
1992 年Lambden 等在克隆dsRNA 病毒基因组技术方面取得了突破, 首先用单引物扩增方法成功地扩增了人类轮状病毒基因组中较大的基因片段(3~4kb)。后来这种方法经过不断改进和完善, 现在已经比较成熟, 成为克隆dsRNA 病毒基因组已知或未知基因片段的主要方法之一 。另外这种方法主要是在克隆动物dsRNA病毒基因组取得了比较大的成功, 在植物dsRNA 病毒基因组的克隆中成功的很少, 可能是由于植物dsRNA 病毒基因组结构与动物dsRNA 病毒基因组不同所致[3]。
单引物法是在添加poly(A)尾方法的基础上进行改进而来的。加poly(A)尾法是在dsRNA3`端添加多聚A尾,而单引物法则是在3`末端加上一段3`端被氨基修饰了的DNA寡核苷酸序列作为接头(primer1),接着用与此接头互补的DNA寡核苷酸序列作为引物2,进行反转录,获得DNA-RNA杂合双链,多条杂合双链经变性、复性、延伸,可获得DNA双链。以此双链DNA为模板,primer2为引物进行PCR,即可获得大量cDNA产物。将此cDNA连接到适宜的载体上,经克隆后即可进行序列测定。福建农林大学植物病毒所利用这种方法成功克隆了水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus , RDV) 基因组片段S11 、S12[3]。武汉大学病毒研究所的胡建芳等人运用该法完成了马尾松毛虫质型多角体病毒地第8片段的克隆[7] 。
单引物法不受任何序列限制,适用于任何已知或未知序列的dsRNA克隆[4],而且比随机引物法简便,快捷,是一种省时省力的dsRNA克隆方法。
五、序列片段扣除法
序列片断扣除法是单引物扩增法的延伸。其原理是先获得多条片断的dsRNA,经单引物扩增法克隆、测序,拼接成完整的dsRNA序列;再据此设计特异性引物,经PCR扩增得到的cDNA,再与总的dsRNA片断进行杂合,可与其中已知序列的一条dsRNA形成RNA-DNA杂合体,该杂合体在RNase的作用下,将这条已知的dsRNA片断去处,然后再进行单引物扩增,得到全长cDNA。该方法同样具有工作量大和面临随即拼接和重复操作的困难,片段越长难度越大。这一方法没有人重复,但在理论上具有借鉴意义[1]。

经过几十年的研究,dsRNA克隆方法由繁琐、复杂到简单、快捷,取得了很大进步,同时dsRNA克隆方法与其他生物技术广泛结合,进一步拓展了研究范围。例如双链RNA(dsRNA)在RNA 沉默启动中所起中心作用的认知,形成了几种RNA 沉默载体的构建方法,这些方法与基因组资源相结合,通过转基因或非转基因的方法能够快速和高效研究植物的基因功能;另外可以利用病毒mRNA前体再生成dsRNA病毒的原理来研究病毒的寄主因子、寄主靶标;同时结合RNAi技术,利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒入侵,或设计针对多个基因同源保守序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除,从而起到抑癌作用。因此,对于dsRNA克隆方法的研究具有很强的理论意义和现实意义。

参考文献
1.两种浸染萝卜的双链RNA病毒研究. 陈亮. 浙江理工大学生物工程研究所. 硕士学位论文,2006
2.一种快速、简便、高效cDNA 合成及克隆策略. 田静,方勤 中国科学院武汉病毒研究所, 2000
3.一种实用的双链RNA 病毒基因组克隆方法. 章松柏, 吴祖建, 段永平, 谢联辉, 林奇英 福建农林大学植物病毒所,2005
4.Cloning of non cultivable human rotavirus by single primer amplification. Lambden, P.R., Cooke, S.J., Caul, E.O., Clarke, I.N., Department of Microbiology, University of Southampton Medical School, Southampton General Hospital, United Kingdom,1992
5.A simple and rapid method for cloning insect vitellogenin cDNAs. Jae Min Lee , Masatsugu Hatakeyama , Kugao Oishi,Graduate School of Science and Technology, Kobe University, Japan,Department of Biology, Faculty of Science, Kobe University, Japan,1999
6.A strategy for rapid cDNA cloning from double-stranded RNA templates isolated from plants infected with RNA viruses by using Taq DNA polymerase,Yun-ping Zhang, Adib Rowhani,Department of Plant Pathology, Uni6ersity of California, One Shields A6enue, Da6is, USA,1999
7.单引物法扩增马尾松毛虫CPV基因组第8片段及其序列分析. 胡建芳,张珈敏,杨绢,邓晓军,汪洋,胡远扬,武汉大学病毒研究所,2003
8.鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆及序列分析. 刘小军,陈楠,陈永福,中国农业大学生物技术国家重点实验室,1999
9.葡萄卷叶病毒外壳蛋白基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达. 张玉满,李云,田砚亭,腊平,蔡文启,北京林业大学良种繁育研究中心,中科院微生物所植物生物技术实验室,2000
10.Sequence-independent amplification and cloning of large dsRNA virus genome segments by poly(dA)-oligonucleotide ligation. F.T. Vreede , M. Cloete , G.B. Napier , A.A. van Dijk, G.J. Viljoen,Onderstepoort Veterinary Institute, Onderstepoort 0110, South Africa,1998
11.Cloning and sequence analysis of dsRNA segments 5, 6 and 7 of a novel non-group A, B, C adult rotavirus that caused an outbreak of gastroenteritis in China. H. Yang , E.V. Makeyev , Z. Kang, S. Ji, D.H. Bamford , A.A. van Dijk, Institute of Biotechnology and Faculty of Biosciences, University of Helsinki, Biocenter 2, P.O. Box 56 (Viikinkaari 5), FIN-00014 Helsinki, Finland, The Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206, China Department of Virology, Hebei Province Public Health and Anti-Epidemic Centre, Shijiazhuang, 2004
12.Strategies for the sequence determination of viral dsRNA genomes. Houssam Attoui, Fre´de´rique Billoir , Jean Franc¸ois Cantaloube ,Philippe Biagini , Philippe de Micco , Xavier de Lamballerie,Unite´ des Virus Emergents, Laboratoire de Virologie Mole´culaire, EFS Alpes-Me´diterrane´e, 27 Boule6ard Jean Moulin,13005 Marseille cedex 5, France,Unite´ des Virus Emergents, Laboratoire de Virologie Mole´culaire, Tropicale et Transfusionnelle, Faculte´ deMe´decine de Marseille, Uni6ersite´ de la Me´diterrane´e, 27 Boule6ard Jean Moulin, 13005 Marseille cedex 5, France,2000
13.草鱼出血病病毒基因组的cDNA 合成、克隆及部分序列分析. 田静,邹桂平,方勤,中国科学院武汉病毒研究所,1999
14.水稻矮缩病毒第十二号基因组份的cDNA 合成与分子克隆及全序列分析. 李毅, 刘一飞, 陈章良等,北京大学生命科学学院,1994
15.Molecular cloning of double-stranded RNA genomes. Imai, M., Richardson, M.A., Ikegami, N., Shatkin, A.J., Furuichi, Y.,USA,1983
16.分子克隆实验指南(第三版),[美]萨母布鲁克(Sambrook, J.)等著 黄培堂等译,2002年08月第1版
17.文山松毛虫质型多角体病毒S8片段cDNA克隆与原核表达,段兵,赵淑玲,张海元,张小霞,肖宇宙,汤显春,彭辉银,中国科学院武汉病毒研究所分子病毒学重点实验室,2004
18.玉米粗缩病毒基因组第七组份的cDNA克隆及序列分析. 邓文生,杨希才,张玉满,刘玉乐,康良仪,中国科学院微生物研究所分子病毒学与生物工程开放实验室,2000
19.The genome sequence, full-length infectious cDNA clone, and mapping of viral dsRNA accumulation determinant of hypovirus CHV1-EP721.Lin H, Lan X, Liao H, Parsley TB, Nuss DL, Chen B,Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresource Conservation and Utilization, The Key Laboratory of Ministry of Education of China for Microbial and Plant Genetic Engineering, Guangxi University, 100 Daxiu Road, Nanning, Guangxi 530004, PR China; Center for Biosystems Research, 5115 Plant Sciences Building, University of Maryland Biotechnology Institute, College Park, Maryland,2006
20.Cloning and nucleotide analysis of segment A gene of infectious bursal disease virus detected in Korea. Kim TK, Yeo SG,2003
 


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