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端粒酶活性测定方法汇总

发布者:鑫达医学翻译 发布时间:2012-10-24 8:50:52 阅读:

    现有的检测端粒酶活性的方法主要是端粒重复序列扩增法(Telomere repeat amplification protocol, TRAP)及其后续的完善方法。对端粒酶进行定性或者半定量的检测。
    端粒重复序列扩增法用一段人工合成的长度为26 nt末端有几个碱基与端粒酶模板RNA进行碱基互补配对的寡聚核苷酸TS前导引物(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’)作为端粒酶延伸的底物。在体外条件下端粒酶催化合成一轮端粒重复序列后,端粒酶模板RNA发生移位,模板RNA与新合成的端粒重复序列进行配对,进行下一轮端粒重复序列的合成。寡聚核苷酸被延伸成为含有多个端粒重复序列长度为100~200 nt的DNA单链结构。此后利用一段与端粒重复序列进行碱基配对的长度为24nt的CX反向引物(5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA)与TS引物进行PCR扩增,PCR扩增过程中用同位素标记dGTP。为了避免引物之间形成引物二聚体,将反向引物进行了三个碱基的错配。PCR扩增结果进行PAGE电泳分离,经过Northern印记的方法进行长度检测。检测到长度为6 nt的DNA梯度。该方法比较灵敏的检测到85%的癌细胞内具端粒酶活性。此种方法灵敏度较高,也是目前最常用的一种检测端粒酶活性的方法。但是此种方法受到引物二聚体的影响,此外由于反应过程中的端粒酶提取液还可能抑制PCR过程中Taq酶的活性,导致PCR反应的假阴性。且该方法不适合少量样品的测定,影响了此种方法在端粒酶活性检测方面的广泛应用。后续的修改方案主要是围绕消除引物二聚体的影响,简化原始方法原有的繁琐的实验过程,及定量检测端粒酶的活性。
    TRAP-ELISA法:该方法是将TRAP与ELISA结合的一种方法。TS引物5′端标以生物素,PCR扩增后,将产物变性,加入地高辛标记的可与扩增产物的重复片断特异结合的探针,杂交产物上的生物素与固定在微孔板上的卵白素相结合,而探针上的地高辛与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体结合,然后加入底物,显色后用酶标仪测定。ELISA法是一种使用试剂盒的方法,由于没有进行电泳分离,因此观察不到6 bp差异的梯带。与同位素TRAP相比在操作上进行了简化,但是价格相对比较昂贵。
    基于荧光定量技术的端粒酶活性测定方法:2001年Hou等人报导了一种与传统的TRAP结合的方法。利用TS引物作为端粒酶延伸的底物,端粒酶延伸后PCR引物采用ACT引物。采用SYBR Green染料进行染色,根据荧光的强度测定端粒酶延伸端粒底物的效率。用该方法检测出传统的TRAP检测方法在测定上高估了端粒酶的活性。且在端粒酶延伸人工合成的寡聚核苷酸的过程中,不需要原先报道的酶提取液的含量,削弱了PCR过程中酶提取液中含有的抑制剂对Taq酶活性的影响。此种方法准确性可靠,且不用进行PCR后的电泳,杂交等,操作便捷。但是成本较高,难以在一般实验室进行端粒酶活性的检测。


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